Jak w laboratorium rozwiązać kryminalną zagadkę? Przez włos do DNA!

20-03-2016
Pamiętacie te sceny z filmów kryminalnych, kiedy to ekipa poważnych panów detektywów przeczesuje miejsce domniemanej zbrodni w poszukiwaniu śladów, które naprowadzą ich na winnego? Po wielu godzinach znajdują wreszcie jeden włos i na podstawie zebranego z niego DNA są w stanie określić, kto powinien pójść za kraty. Albo te łzawe programy, w których rozhisteryzowane pary konfrontują się przed kamerami, następnie przeprowadzają test na ojcostwo i ostatecznie przekonują się, że ich wspólne dziecko jest tak naprawdę nosicielem genów pana Romana spod ósemki. We wszystkich tego typu sytuacjach do izolowania i identyfikacji DNA używa się dokładnie tej samej reakcji, która w filmach przedstawiana jest zazwyczaj w scenie naukowcy w milczeniu patrzą na komputer. Niezbyt pasjonujące, co nie? Tymczasem reakcja PCR, bo to o niej mowa, jest nie dość, że pięknie przemyślana i bardzo zgrabna, to jeszcze na tyle doniosła, że w 1993 roku jej odkrywca, Kary Mullis, otrzymał Nagrodę Nobla. To jak? Wcielamy się dzisiaj w ekipę naukowców z filmu? Chodźcie!

Co to znaczy PCR?

PCR to po angielsku polimerase chain reaction, a po polsku reakcja łańcuchowa polimerazy. Polimeraza to enzym, który wykorzystywany jest do syntetyzowania nowej nici DNA, a o tym, dlaczego cała reakcja ma charakter łańcuchowy, powiemy sobie za moment.

Do czego ją wykorzystać?

Dobra. To załóżmy, że jesteśmy już w laboratorium, smutni detektywi właśnie dostarczyli nam próbkę jakiegoś DNA i chcą, żebyśmy odpowiedzieli im na pytanie, czy jest ono zgodne z DNA podejrzanego o dokonanie zbrodni. Jaki mamy problem? Ano taki, ze detektywi dostarczyli nam DNA z tylko jednego włosa, a to oznacza, że jest go tam bardzo mało. Na tyle mało, że tak właściwie nie jesteśmy w stanie przeprowadzić na jego podstawie żadnych analiz. I właśnie tu z pomocą wkracza nam PCR, za pomocą której jesteśmy w stanie zamplifikować, czyli namnożyć sobie obecne w próbce DNA tak, aby móc się z nim dalej bawić. Okej. Zakładamy fartuchy i przystępujemy do działania.

Na początek musimy zdać sobie sprawę z tego, że wszyscy ludzie na świecie dzielą ze sobą mniej więcej 99,9% DNA. Oznacza to, że poszukując sekwencji charakterystycznej dla naszego domniemanego zbrodniarza, musimy namierzyć te 0,1%, które będą odróżniać go od wszystkich innych ludzi. To o,1% DNA nazywa się genetycznym odciskiem palca – można przyjąć, że na podstawie tego niewielkiego kawałka genomu da się odróżnić ludzi między sobą. Bez wchodzenia w szczegóły – znajdujemy więc sobie takie wysoce zmienne miejsce w genomie i to nad nim będziemy się pastwić. Do dzieła!

Czego potrzebujemy?

Tak właściwie tylko pięciu rzeczy:

Plik_000 (7)

  • Polimeraza DNA – to enzym, który będzie kopiować dla nas ten fragment DNA, który stanowi genetyczny odcisk palca podejrzanego. W reakcjach PCR najczęściej wykorzystuje się polimerazę Taq, która izolowana jest z ciepłolubnych bakterii, które świetnie radzą sobie w temperaturze około 100 stopni Celsjusza. W związku z tym ich polimeraza – w przeciwieństwie do ludzkiej – nie denaturuje w podwyższonej temperaturze i za moment tę cechę wykorzystamy.
  • Matrycowy DNA – czyli po prostu próbka DNA podejrzanego (w naszym wypadku będzie nim to, co udało się wyizolować z włosa). To ona będzie służyć polimerazie za matrycę, czyli wzór, na podstawie którego ma ona namnażać ten charakterystyczny fragment, nazywany przez nas genetycznym odciskiem palca.
  • Starter – to krótki fragment DNA, który posłuży nam do tego, by naprowadzić polimerazę w odpowiednie miejsce. Czyli dokładnie w to, w którym sekwencja genetycznego odcisku palca się rozpoczyna. Bez startera polimeraza nie miałaby pojęcia, dokąd się udać i co tak naprawdę powinna syntetyzować.
  • Wolne nukleotydy – czyli kawałki, z których polimeraza będzie składać nowe nici DNA.
  • Bufor – czyli roztwór, w którym znajduje się wszystko to, co jest potrzebne, by polimerazie było dobrze, by DNA się nie rozpadło i by reakcja zaszła tak jak chcemy.

No. To teraz wrzucamy to wszystko do probówki i ładujemy ją do pewnego tajemniczego urządzenia. Termocyklera. Termocykler to taki sprzęt, który w zależności od instrukcji, jakie mu wydamy, zmienia temperaturę inkubacji probówki z reagentami PCR. Raz je podgrzewa, raz studzi, a wszystko po to, by reakcja mogła zajść tak jak chcemy.

Podgrzewanie i studzenie

Termocykler na początku podnosi temperaturę do bardzo wysokich wartości, powiedzmy do dziewięćdziesięciu kilku stopni. W takich warunkach nici matrycowego DNA rozplatają się:

Plik_000 (6)

Odłączające się od siebie nici DNA. Schemat.

Gdy nici są już osobno, do akcji, w temperaturze jakichś 60 stopni, wkroczyć mogą startery:

Plik_000 (5)

Starter określający miejsce rozpoczęcia syntezy nowej nici DNA. Schemat.

Startery dają polimerazie znać, gdzie powinna rozpocząć pracę. Teraz termocykler zmienia temperaturę na jakąś w granicach 70-75 stopni, co uaktywnia polimerazę i pozwala jej na zsyntetyzowanie nowej nici DNA. Nici, która będzie stanowić wierną kopię DNA naszego podejrzanego. To właśnie ten etap jest celem, dla którego przeprowadzamy całą reakcję.

Plik_000 (4)

Polimeraza syntetyzująca nową nić DNA. Schemat.

Cała ta sekwencja zmian temperatur powtarzana jest w wielu cyklach. Po co? Otóż w każdym następnym powtórzeniu startery mogą przyłączać się nie tylko do DNA pochodzącego od naszego podejrzanego, ale także do nici, które zostały właśnie skopiowane przez polimerazę. W związku z tym produktu przybywa w probówce w sposób geometryczny – w teorii po każdym kolejnym cyklu, powinniśmy otrzymywać 2 do potęgi n produktu, gdzie n jest właśnie liczbą pełnych cykli podgrzewań i ochłodzeń. To właśnie dlatego reakcja polimerazy określana jest jako łańcuchowa. 

No dobra, mamy DNA, ale co teraz?

Na tym etapie udało nam się skopiować DNA podejrzanego, tak abyśmy nie musieli pracować na niesłychanie małej próbie, tylko mieli do dyspozycji sporą jego ilość. Co teraz? Musimy przecież porównać, czy nasza próbka ma się jakoś do próbki pobranej od podejrzanego. W tym celu otrzymane DNA najczęściej poddaje się elektroforezie. W skrócie polega ona na tym, że próbkę z DNA nanosi się na niewielką płytkę wykonaną ze specjalnego żelu. Tę umieszcza się zaś w roztworze, który przewodzi prąd, a potem odpala zanurzone w nim elektrody i czeka. Przepływający prąd zmusza cząsteczki DNA do przemieszczania się wzdłuż płytki, a ponieważ jest ona wykonana z gęstego żelu, cząsteczki migrują z różną szybkością. Im mniejsze, tym łatwiej jest im przedzierać się przez żelowe ziarenka, a im większe, tym dłużej tkwią w tym samym miejscu. Po dostatecznie długim czasie, cząsteczki o różnych wielkościach oddalą się od siebie i utworzą na płytce wzór wyglądający jak prążki. W związku z tym, że badaliśmy fragment DNA specyficzny dla każdego człowieka, prążki każdego z nas układać będą się w inny wzór. Ostatecznie otrzymamy więc coś takiego:

Plik_000 (3)

I to właśnie na tej podstawie ocenimy, czy DNA z dostarczonego przez detektywów włosa pasuje do DNA któregoś z podejrzanych.

Dziś udało nam się wspólnymi siłami zidentyfikować sprawcę. Serdecznie wszystkim gratuluję, proszę o ściągnięcie fartuchów i umycie rąk. Do następnej zbrodni!

Buzi!