Zrób to sam: klonowanie, strzelanie działem biologicznym i nokautowanie protistów

30-07-2016

– To ty tak całe wakacje siedzisz w laboratorium? A co tam w ogóle robisz? – zapytała Krysia.

W odpowiedzi na to pytanie, przeprowadziłam specjalnie dla niej półgodzinny wywód, w trakcie którego ze szczegółami zapoznałam ją z zakresem moich obowiązków w laboratorium, podstawami biologii molekularnej oraz inżynierii genetycznej, a następnie bardzo zadowolona z siebie, zapytałam ją, co o tym sądzi. Po głębokim namyśle, Krysia odparła:

– Yyy… Nic nie zrozumiałam. Jakbyś mi narysowała kasirysik, to może…

Zrozumiałam wtedy, że odpowiedź na pytanie Krysi jest tak naprawdę bardzo prosta. Otóż w laboratorium klonuję geny, strzelam działem biologicznym i nokautuję protisty. Pozwólcie więc zatem, że zabiorę was dziś do laboratorium, szybko pokażę, o co chodzi, a potem wspólnie znokautujemy sobie jedno stworzonko. Zakładajcie fartuchy i za mną!

[su_spacer]

Na początku poznajcie się z Tetrahymeną:

smutna tetrahymena

Tetrahymena to protist, czyli takie ani zwierzę, ani roślina, ani bakteria, ani nawet grzyb, ani w ogóle nie wiadomo co. Choć nie widać tego na zdjęciu, Tetrahymeny obrośnięte są rzęskami, które pozwalają im pływać. I to właśnie z tą ich cechą związane jest nasze dzisiejsze zadanie. Polega ono na tym, by zepsuć Tetrahymenie jeden gen, który podejrzewany jest o pełnienie ważnej roli w wykształcaniu się funkcjonalnych rzęsek. Jeśli faktycznie gen ten okaże się ważny, po jego zepsuciu, powinniśmy zobaczyć, że z rzęskami jest coś nie tak.

KASIRYSIK - 105

Geny psuć można na dwa sposoby: albo obniżając poziom ich ekspresji (ten sposób nazywa się knock-down), albo po prostu je wyłączając (tę metodę nazywa się knock-out) i to właśnie nokautowaniem zajmujemy się dzisiaj. [su_spacer]

Jak znokautować protista?

Czy da się wziąć jakieś genetyczne nożyczki i po prostu wyciąć z Tetrahymeny to, czego nie chcemy? Hm… W teorii tak, ale my zrobimy dzisiaj wszystko jak Pan Jeżu kazał. Nasze zepsucie genu polegać będzie więc na tym, by przerwać jego łączność i wstawić w jego środek dodatkowe coś, co zaburzy nam pierwotną sekwencję. Dzięki obecności takiej wstawki mechanizmy odpowiedzialne za transkrypcję genu wpadną w dezorientację, podejmą protest i przestaną się nim zajmować. Ten psujący wszystko fragment nazywa się kasetą delecyjną, a w naszym przypadku będzie ona jednocześnie nieść oporność na antybiotyk.

KASIRYSIK - 106

Dzięki genowi oporności na antybiotyki będziemy mogli w łatwy sposób odróżnić Tetrahymenę z zepsutym genem od tej, która posiada jego pierwotną wersję. Pierwsza wyrośnie na podłożu z antybiotykiem, a druga nie.

[su_spacer]

Do roboty!

Na samym początku izolujemy z Tetrahymeny jej DNA. To ta nudna część roboty – DNA ze stworzonek wyciąga się za pomocą gotowych kupnych zestawów, które nazywa się w labach kitami (choć oczywiście można babrać się z własnoręcznie przygotowanymi odczynnikami, taka izolacja jest jednak mniej wydajna). Potem z tego DNA namnażamy sobie ten jeden konkretny, interesujący nas gen (kto jest ciekawy szczegółów, może zajrzeć tutaj, gdzie pisałam o reakcji PCR).

Teraz, gdy mamy już dużo genu, możemy zacząć się nim bawić. Ale zapomniałam o jednym. Bo pamiętacie zdjęcie Tetrahymeny z samego początku? Jej mina na nim zdradza wiele o charakterze tego żyjątka. Tetrahymeny nie lubią współpracować, są skomplikowane i bardzo źle znoszą, gdy grzebie im się w brzuszkach oraz próbuje majstrować przy genach. W związku z tym cała zabawa i przygotowanie konstruktu do nokautu odbywać będzie się w bakteriach. Właśnie dlatego musimy przeprowadzić… [su_spacer]

Klonowanie!

Choć może się tak kojarzyć, w naszym kontekście klonowanie polegać będzie (niestety) nie na tym, by otworzyć masową produkcję Bradów Pittów (choć to też chciałabym kiedyś uczynić), lecz na tym, by wyciągnąć gen z Tetrahymeny i przykleić go do czegoś, z czym polubi się bakteria, tak by ta ostatnia nie zorientowała się, że wsadziliśmy jej do brzuszka obce DNA. Geny najczęściej przykleja się do plazmidów, czyli dodatkowych, bajeranckich cząsteczek DNA, które bakterie mogą (lecz nie muszą) posiadać oraz które często nadają im różnych supermocy, np. oporności na antybiotyk lub zdolności do żywienia się nietypowymi substancjami.

Plazmid to nic innego jak mała, kolista cząsteczka DNA (to znaczy taka, której łańcuch tworzy pętelkę). Plazmidy do klonowania można konstruować samodzielnie lub zlecić to zadanie komuś mądrzejszemu i działać na gotowcu. Ja skorzystałam oczywiście z opcji numer dwa, a mój plazmid wygląda mniej więcej tak:

KASIRYSIK - 107

Wesoły plazmid. Schemat.

Widzicie te dwa kolorowe miejsca, do których chcemy doczepić obydwie nogi genu? Aby móc coś tam przykleić, musimy najpierw wyciąć w plazmidzie dziurę i do tego zadania oddelegujemy enzymy restrykcyjne.

Choć mają trudną nazwę, tak naprawdę można byłoby nazywać je po prostu nożyczkami, bo zajmują się one przecinaniem DNA, bez żadnej większej filozofii. Nie robią tego jednak w sposób losowy, tylko wynajdują sobie ściśle określone sekwencje, w pobliżu których stają się aktywne. Dzięki zmyślnemu zaprojektowaniu plazmidu można więc umieścić te sekwencje (tzw. miejsca restrykcyjne) w takich rejonach, by w plazmidzie łatwo wytrawiało się potrzebne nam dziury. O zobaczcie, na przykład tu, gdzie litery X, Y, Z i W:

KASIRYSIK - 108

Miejsca restrykcyjne enzymów X, Y, Z i W w wesołym plazmidzie. Schemat.

Chwytamy zatem za nasze genetyczne nożyczki i w pierwszym podejściu wykonujemy dwa cięcia. Pierwsze – w miejscu X, a drugiew miejscu Y. Dzięki temu nasz okrągły plazmid jest teraz dziurawy, a powstała  pusta przestrzeń idealnie nadaje się do tego, by wkleić do niej lewą nogę naszego genu. Za przyklejanie odpowiedzialna jest ligaza DNA. Ligaza jest enzymem, który łączy ze sobą fragmenty DNA, a jeśli przyjmiemy, że enzymy restrykcyjne są nożyczkami, to ligazę spokojnie możemy nazwać klejem.

KASIRYSIK - 109

Podstawowa funkcja ligazy DNA. Schemat.

Pierwsza noga genu jest już więc w plazmidzie. Teraz wystarczy jeszcze tylko powtórzyć całą tę sekwencję działań dla drugiej nogi, tj. znowu wytrawić w plazmidzie dziurę i wstawić w nią fragment genu, i… voila! Mamy gotowy plazmid! Klonowanie powiodło się!

Jest tylko jeden problem. Plazmidu jest strasznie mało. Musimy go namnożyć, a aby to zrobić konieczna będzie… [su_spacer]

Transformacja!

Transformacja to proces, w trakcie którego każemy bakteriom wsadzić nasz gotowy plazmid do swoich brzuszków. Bo wiecie, to nie jest tak, że bakterie są zawsze chętne i gotowe do tego, by takie plazmidy zjadać. Konieczna będzie tu terapia szokowa, a dokładniej szok cieplny. Polega on na tym, by bakterie najpierw inkubować tam, gdzie jest bardzo chłodno (np. w lodzie), a następnie na kilkadziesiąt sekund przełożyć do miejsca, gdzie jest bardzo gorąco (np. do gorącej wody). W wyniku takiego niezbyt delikatnego traktowania, błona komórkowa bakterii rozluźni się i sprawi, że plazmidy będą mogły się przez nią przecisnąć.

KASIRYSIK - 110

Taką wyluzowaną bakterię wraz z połkniętym plazmidem zostawiamy na pożywnej pożywce i pozwalamy się jej (oraz plazmidowi) namnożyć. Gdy hodowla jest już dostatecznie gęsta, izolujemy z bakterii nasz plazmid (znowu – za pomocą gotowych, kupowanych kitów) i przystępujemy do ostatniego etapu misji. [su_spacer]

Strzelanie!

Aby przygotowany przez nas konstrukt mógł znaleźć się w komórce Tetrahymeny, musimy wsadzić ją do działa biologicznego i… postrzelić. To okrutne, wiem, ale życie nie zawsze jest kolorowe.

KASIRYSIK - 111

Żeby mieć czym strzelać, potrzebne nam są oczywiście naboje. Te przygotowuje się mieszając baaardzo rozdrobnione złoto z wyizolowanym z bakterii DNA. Dzięki zastosowaniu odpowiednich buforów, DNA oblepi w takim układzie mikroskopijnej wielkości kuleczki złota, tworząc tym samym nasz nabój. Takie naboje umieszcza się nad hodowlą Tetrahymen i… bombarduje się je.

Część strzałów jest oczywiście chybiona, część złota ląduje w cytoplazmie, gdzie DNA jest szybko degradowane, jednak jeszcze inna część wstrzeliwuje się do jądra komórkowego. Tam nasz konstrukt ma szansę znaleźć się w pobliżu genu, który chcemy wyłączyć, a jeśli tak się stanie, Tetrahymena przeprowadzi proces zwany rekombinacją homologiczną. Mówiąc w skrócie – Tetrahymena samodzielnie i o nic nie proszona po prostu wbuduje w swój genom nasz konstrukt i niczego nie podejrzewając, pozbawi się jednocześnie pierwotnej wersji interesującego nas genu. A to oznacza, że… Udało się! Znokautowaliśmy protista!

KASIRYSIK - 112

Teraz pozostaje już tylko hodować Tetrahymenę na podłożu z antybiotykiem i obserwować, czy jej rzęski faktycznie różnią się od normalnych. Jeśli tak będzie, prawdopodobnie udało nam się zidentyfikować ważny gen. Jeśli nie, poszukiwania będą trwać dalej!

[su_divider top=”no”]

No. To teraz możecie już zdjąć fartuchy i wymyć rączki. Ja lecę do Krysi pokazać jej ten post, a wy dajcie znać, czy wszystko jasne!

[su_icon icon=”icon: heart”]Buzi![/su_icon]

8 odpowiedzi na “Zrób to sam: klonowanie, strzelanie działem biologicznym i nokautowanie protistów”

  1. Maja Puente pisze:

    Coś czuję, że maturka z biologii będzie napisana na 100%.

  2. Wojciech pisze:

    Dobre ;) Mam pytanie – w ostatniej części piszesz, że DNA może się nie wbudować w DNA Tetrahymeny – w którym momencie potwierdza się czy to się stało czy nie? Czy dopiero po sprawdzeniu tego żyjątka na podłożu z antybiotykiem izoluje się znów jego DNA (które podejrzewamy o to, że je zepsuliśmy) i sprawdzamy, czy faktycznie tak się stało?
    Z wyrazami ;)

  3. Hania N pisze:

    Dlaczego Ty mnie nie uczyłaś biologii molekularnej?
    Już bym była na doktoracie i szykowała się do Nobla :) Nawet jakbym miała 8 lat.
    Plazmidy z supermocami, pożywne pożywki i inne cuda – Kasiu wyzywam Cię – napisz nową Biologię Villego czy inną Biochemię Strayera. Z kasirysikami oczywiście :)

  4. Łaaa! Kasia, widzę Cię jako wykładowcę z #kasirysikami <3

  5. michalina91 pisze:

    Jakby podręczniki w szkole były stworzone z kasirysików to bym na pewno miała lepsze oceny <3

Dodaj komentarz

Twój adres email nie zostanie opublikowany. Pola, których wypełnienie jest wymagane, są oznaczone symbolem *